دانلود پایان نامه

عنوان : مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

دانشگاه شیراز

دانشکده علوم

 

پایان­  نامه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی(علوم سلولی و مولکولی)

 

مطالعه اثر مایعات یونی بر پایداری و فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس

 

 

استاد راهنما:

دکتر حمیدرضا کربلایی حیدری

 

دی ماه ۱۳۹۳


(در فایل دانلودی نام نویسنده موجود است)
تکه هایی از متن پایان نامه به عنوان نمونه :
(ممکن است هنگام انتقال از فایل اصلی به داخل سایت بعضی متون به هم بریزد یا بعضی نمادها و اشکال درج نشود ولی در فایل دانلودی همه چیز مرتب و کامل است)
چکیده
مایعات یونی را می­توان به عنوان محیط واکنش­های بیوکاتالیز جایگزین­هایی سبز برای حلال­های آلی به شمار برد. ترکیبات مختلفی از کاتیون­ها و آنیون­ها را می­توان جهت دست­یابی به طیف وسیعی از مایعات یونی با ویژگی­های فیزیکی شیمیایی مختلف به کار برد. با توجه به گستره وسیع خصوصیات مایعات یونی، نیاز است که مایعات یونی مناسب برای هر آنزیم خاص و هر محیط واکنش خاص مشخص شود. آنزیم لیپاز ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس (TTL) یک لیپاز مقاوم به دما است که اختصاصیت انانتیومری خوبی نسبت به الکل­های ثانویه دارد. بنابراین از TTL می­توان به عنوان یک آنزیم بالقوه صنعتی، در انجام واکنش های تفکیک مخلوط­های راسمیک استفاده کرد. در این پژوهش فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در حضور غلظت­های مختلف مایعات یونی [CnMIM][Br] (12، ۶، ۴، ۲ = n) مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به این موضوع که پایداری دمایی آنزیم در محیط­های حاوی مایعات یونی یک شرط مهم برای استفاده از این محیط­ها در فرآیندهای صنعتی می­باشد، پایداری دمایی آنزیم از نظر سینتیکی و ساختاری در ۱۰ نوع مایع یونی با کاتیون­ها و آنیون­های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج افزایش فعالیت هیدرولازی و پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی نسبت به محیط بافری را نشان می­دهد. غلظت بهینه مایعات یونی [CnMIM][Br] در جهت افزایش فعالیت آنزیمی نیز به دست آمد. نتایج نشان داد که آنزیم TTL به ترتیب در غلظت های ۳/۰، ۱ و ۳/۰ مولار از مایعات یونی [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] بهترین فعالیت را داشته است. در حالی­که در مورد مایع یونی [C12MIM][Br] هیچ اثر مثبتی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم مشاهده نشد. همچنین مشخص گردید که نوع کاتیون و نوع آنیون مایعات یونی، شدت اثر آن­ها بر پایداری آنزیم TTL را تحت تأثیر قرار می­دهد. نوع آنیون به دلیل اندازه کوچک و چگالی بار بالایی که دارند، اهمیت بیشتری نسبت به نوع کاتیون دارد. در مقایسه­ای که بین مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهای بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مایع یونی دارای آنیون PF6 اثر پایدارکننده بیش­تری را برای آنزیم TTL ایجاد کرد. پایداری آنزیم در حضور مایعات یونی با طول زنجیره آلکیلی کوتاه و متوسط، مشابه بود. هرچند مایعات یونی با زنجیره کاتیونی طویل اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم می­گذارند. همچنین در این پژوهش نشان داده شد با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمی­ شود. مطالعات ساختاری پایداری دمایی آنزیم پس از حرارت­دهی در °C 85، با روش اسپکتروسکوپی فلورسانس نیز انجام شد. مطالعه فلورسانس ذاتی TTL نشان داد که در مایعات یونی با آنیون PF6 ساختار آنزیم تا حد زیادی حفظ می­شود؛ به طوری که تفاوت کمی بین شدت نشر فلورسانس قبل و بعد از ۱ ساعت حرارت­دهی در °C 85 دیده می­شود. در مایعات یونی [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] بعد از ۴۵ دقیقه آنزیم همچنان بیش از ۵۰ % از فعالیت خود را حفظ کرد. این درحالی است که پایداری آنزیم در محیط آبی در دماهای بالاتر از °C 80 کمتر از ۱۵ دقیقه است. با توجه به یافته های پژوهش حاضر، می توان از آنزیم TTL برای کاتالیز فرایند­های زیستی در مایعات یونی و دماهای بالا بهره برد.
کلمات کلیدی: مایعات یونی، لیپاز، ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس ، پایداری دمایی.
 
 
 
فهرست مطالب
 
 

  •  سایت ما حاوی حجم عظیمی از پایان نامه های مقطع ارشد می باشد برای جستجو در بقیه پایان نامه ها می توانید کلمه کلیدی مورد نظر خود را در سایت جستجو نمایید:

        

عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
 
 
۱-۱- آنزیم­ها ۲
۱-۲- لیپازها ۳
۱-۲-۱- ارتباط ساختار آنزیم لیپاز با عملکرد آن ۵
۱-۳- آنزیم­ها در محیط آلی ۶
۱-۴- مایعات یونی ۸
۱-۵- بیوکاتالیز در مایعات یونی ۹
۱-۵-۱- آنزیم­ها در مخلوط­های مایع یونی – آب ۱۰
۱-۵-۲- فعالیت آنزیم­ها در شرایط نسبتا بی­آب در مایعات یونی ۱۱
۱-۵-۳- پایداری آنزیم­ها در مایعات یونی تقریبا بی­آب ۱۳
۱-۵-۴- آنزیم­ها، مایعات یونی، پیوندهای هیدروژنی و فعالیت ۱۳
۱-۵-۵- بیوترانسفورماسیون در محیط مایعات یونی توسط لیپاز­ها و استرازها ۱۴
۱-۶- بررسی ساختار پروتئین به روش اسپکتروسکوپی فلورسانس ۱۵
فصل دوم: مروری بر پژوهش­های پیشین
 
 
 
۲-۱- پیشینه کاربرد مایعات یونی در بیوکاتالیز ۱۸
۲-۲- اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم ۱۹
۲-۳- بررسی ساختار آنزیم­ها در مایعات یونی ۲۲
اهداف ۲۳
فرضیه ۲۳
فصل سوم: مواد و روش­ها
 
 
 
۳-۱- ابزار ۲۵
 
عنوان
صفحه
۳-۲- مواد ۲۶
۳-۲-۱- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی ۲۶
۳-۲-۲- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL ۲۶
۳-۲-۲-۱- سوش باکتری ۲۶
۳-۲-۲-۲- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون ۲۶
۳-۲-۲-۳- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی ۲۶
۳-۲-۲-۴- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز ۲۶
۳-۲-۲-۵- مواد مورد نیاز برای سنجش کمی میزان پروتئین و ژل SDS PAGE ۲۷
۳-۲-۳- مواد مورد نیاز برای سنجش فعالیت آنزیمی لیپاز ۲۷
۳-۲-۴- نرم افزارها ۲۷
۳-۳- روش­ها ۲۸
۳-۳-۱- روش تهیه مایعات یونی ۲۸
۳-۳-۱-۱- روش تهیه مایعات یونی با آنیون برمید ۲۸
۳-۳-۱-۲- روش تهیه مایعات یونی با آنیون هگزافلوروفسفات ۲۸
۳-۳-۲- روش کشت باکتری و بیان القایی پروتئین نو ترکیب ۲۹
۳-۳-۲-۱- محیط کشت باکتری E. coli ۲۹
۳-۳-۲-۲- انتقال DNA خارجی به باکتری E.coli ۲۹
۳-۳-۲-۲-۱-  تهیه سلول های مستعد به روش شیمیایی ۲۹
۳-۳-۲-۲-۲- انتقال پلاسمید به سلول مستعد ۳۰
۳-۳-۲-۳- روش تهیه استوک باکتری ۳۱
۳-۳-۲-۴- کشت باکتری و القای بیان آنزیم نوترکیب ۳۱
۳-۳-۲-۵- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب ۳۱
۳-۳-۲-۵- ۱- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL ۳۱
۳-۳-۲-۵-۲- انتخاب بهترین زمان پس از القا ۳۲
۳-۳-۲-۶- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL ۳۲
۳-۳-۳- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL ۳۳
۳-۳-۳-۱- روش رسوب دهی دمایی ۳۳
۳-۳-۳-۱-۱- بهینه سازی رسوب دهی دمایی ۳۳
۳-۳-۳-۲- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی ۳۳
۳-۳-۴- روش سنجش کمی پروتئین ۳۴
۳-۳-۴-۱- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد ۳۴
۳-۳-۴-۲- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280 ۳۴
 
عنوان
صفحه
۳-۳-۵- الکتروفورز ژل پلی­آکریل آمید با SDS (SDS-PAGE) ۳۵
۳-۳-۵-۱- آماده سازی محلول­های الکتروفور ۳۵
۳-۳-۵-۲- آماده سازی سیستم الکتروفورز ۳۶
۳-۳-۶- سنجش فعالیت آنزیمی با سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات ۳۸
۳-۳-۷- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی ۳۹
۳-۳-۸- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا ۳۹
۳-۳-۹- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف ۳۹
۳-۳-۱۰- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی ۴۰
فصل چهارم: نتایج
 
 
 
۴-۱- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب ۴۲
۴-۱-۱- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL ۴۳
۴-۱-۲- بهینه سازی زمان پس از القا ۴۳
۴-۲- تخلیص آنزیم لیپاز TTL ۴۴
۴-۲-۱- بهینه سازی تخلیص نسبی به روش رسوب دهی دمایی ۴۴
۴-۲-۲- تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی Q- سفاروز ۴۵
۴-۳- سنتز مایعات یونی ۴۷
۴-۴- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL ۴۷
۴-۵- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL ۴۸
۴-۵-۱- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی ۴۸
۴-۵-۲- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی ۴۹
۴-۵-۲-۱- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف ۴۹
۴-۵-۲-۲- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی ۵۱
۴-۵-۲-۳- مقایسه اثر نوع کاتیون و طول­های مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم ۵۱
۴-۶- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی ۵۴
فصل پنجم: بحث
 
 
 
۵-۱- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL ۵۷
 
عنوان
صفحه
۵-۲- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL ۵۹
۵-۳- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی ۶۱
فصل ششم: نتیجه­گیری و پیشنهادات
 
 
 
۶-۱- نتیجه­گیری ۶۳
۶-۲- پیشنهادات ۶۳
فهرست منابع ۶۵
چکیده انگلیسی ۷۵

فهرست جدول­ها
 
 

عنوان
 
صفحه
 
جدول۱-۱- میکروارگانیسم­های تولید کننده لیپاز ۴
جدول۲-۱- آنیون­های متداول در مایعات یونی ۱۹
جدول ۳-۱- محیط کشت Luria Bertani ۲۹
جدول ۳-۲- نحوه تهیه محلول TSB ۳۰
جدول ۳-۳- نحوه تهیه محلول KCM ۳۱
جدول ۳-۴- نحوه تهیه محلول برادفورد ۳۴
جدول ۳-۵-  نحوه تهیه بافر نمونه ۴X ۳۷
جدول ۳-۶- نحوه تهیه ژل پلی اکریل آمید ۳۷
جدول ۳-۷- نحوه تهیه مخلوط سنجش فعالیت آنزیم ۳۸
جدول ۴-۱- فعالیت­های لیپازی عصاره­های سلولی کلنی­های ۱ تا ۶ حاصل از ترانسفورماسیون ۴۴
جدول ۴-۲- مشخصات مراحل تخلیص TTL. ۴۶
جدول ۵-۱- غلظت­های بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه ۵۸

فهرست شکل­ها
 
 

عنوان
 
صفحه
 
شکل ۱-۱- آنزیم لیپاز ریزوموکور میهی (PDB entry 3TGL) ۶
شکل ۱-۲- آنیون­ها و کاتیون­های مرسوم در مایعات یونی مورد استفاده در بیوکاتالیز ۹
شکل ۱-۳- آنزیم CALB در حضور مایعات یونی بدون آب ۱۲
شکل۲-۱- ساختارهای نمونه از کاتیون مایعات یونی معمول در بیوکاتالیز ۱۸
شکل ۳-۱- سنتز مایعات یونی با آنیون برمید ۲۸
شکل ۴-۱- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL ۴۲
شکل ۴-۲- بهینه سازی مدت زمان تخلیص به روش رسوب دهی دمایی ۴۵
شکل ۴-۳- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخلیص آنزیم TTL ۴۶
شکل ۴-۴- تصویر ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخلیص آنزیم TTL ۴۷
شکل ۴-۵- اثر غلظت­های مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی ۴۸
شکل ۴-۶- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 ۴۹
شکل۴-۷- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C90 ۵۰
شکل۴-۸- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون ۵۲
شکل ۴-۹-  نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طول­های مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم بر پایداری دمایی آنزیم TTL ۵۳
شکل ۴-۱۰- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL ۵۳
شکل ۴-۱۱- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارت­دهی در °C 85 ۵۴
شکل ۴-۱۲- طیف­های فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6 ۵۵
شکل ۴-۱۳- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] ۵۵

مقدمه
 
 
۱-۱- آنزیم­ها
آنزیم ها کاتالیزورهای زیستی بسیار کارآ هستند که می­توانند سرعت واکنش­ها را تا ۱۷ برابر افزایش دهند(Agarwal, 2006). بخشی از زیست توده[۱] زمین لیپیدها هستند و آنزیم­های لیپولیتیک[۲] نقش مهمی در حذف این مواد نامحلول در آب را دارند. آنزیم­های لیپولیتیک در شکستن و حرکت دادن لیپیدها درون سلول­های یک جاندار و انتقال لیپیدها از یک جاندار به جاندار دیگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزیم­ها مزایای زیادی در انجام واکنش­ها دارند که از جمله آن­ها می­توان اختصاصیت بالای آن­ها، انجام واکنش در شرایط معتدل، کاهش مواد زائد، تعیین نوع محصول و کاهش محصولات جانبی با انتخاب آنزیم مناسب، کاهش هزینه­ها و سرمایه لازم در مقیاس بزرگ، کاهش اتلاف هزینه در فرآیندهای آنزیمی، زیست تخریب پذیر بودن آنزیم­ها، کاهش میزان مصرف کاتالیزور (آنزیم) به میزان ۱%- ۱/۰% سوبسترا را نام برد؛ بنابراین سهم آنزیم در[۳]BOD جریان مواد زائد بسیار ناچیز است (Posorske et al., 1984).
آنزیم­های میکروبی کارآتر از انواع گیاهی و جانوری هستند. آنزیم­های میکروبی دارای تنوع عملکردی بالا، بازده بالا، دست­ورزی ژنتیکی آسان، منبع مشخص (که این به دلیل نبود نوسانات فصلی، رشد سریع باکتری و محیط رشد ارزان قیمت آن می­باشد)، پایداری بیش­تر و تولید آسان­تر نسبت به انواع گیاهی و جانوری هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سریع باکتری­ها و بنابراین آسان­تر بودن فرآیندهای غربالگری در مورد آن­ها، باعث تسهیل فرآیندهایی هم­چون دست ورزی ژنتیکی و ایجاد تغییرات در محیط اطراف سلول، در جهت دست­یابی به بیش­ترین تولید آنزیم، افزایش فعالیت آنزیمی سلول­ها، ایجاد روند تولید پیوسته یا تولید القایی می­شوند. تنها حدود دو درصد از گونه­های میکروبی به عنوان منبع آنزیم بررسی شده ­اند که در این میان سویه های باکتریایی به دلیل فعالیت بالاتر، pH بهینه خنثی یا قلیایی و مقاومت به دما، بیش­تر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفته­اند (Frost and Moss, 1987).
 

تعداد صفحه : ۹۴
قیمت : ۱۴۷۰۰تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]